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脑挫裂伤是一种常见病,随着社会经济水平不断提高及交通工具的发展,脑挫裂伤的发病率持续升高。而小儿活泼好动,其独立和自身保护能力差,故脑挫裂伤的发病率较成年人上升快。因此深入探讨小儿脑挫裂伤的病理生理变化有利于其诊断、治疗和疗效评估,是当前研究热点之一。脑红蛋白 (neuroglobin,Ngb)是继血红蛋白和肌红蛋白之后新发现的一种主要位于神经元内、能够可逆性结合氧的球蛋白。研究表明Ngb主要参与氧在中枢神经系统中的转运与贮存,在神经系统氧摄取、氧运输和氧利用等过程中起着极其重要的作用[1-2],并作为一种内源性神经保护因子,在脑保护、改善神经功能和预后方面起着重要的作用。本课题组前期研究显示,脑外伤后脑组织中NgbmRNA的表达明显升高,但有关Ngb在小儿脑挫裂伤病理生理过程中的变化尚不明确。本研究以脑挫裂伤患儿的脑组织及血清为样本,采用二维凝胶电泳和质谱技术分离、鉴定差异表达蛋白质,并运用免疫组化和酶联免疫法鉴定并观察了差异蛋白Ngb在脑挫裂伤患儿脑组织及血清中表达水平的动态变化,以阐明Ngb在小儿脑挫裂伤病理生理过程中的变化。
1资料与方法
1.1研究对象2011年8月~11月于中南大学湘雅医院就诊的脑挫裂伤患儿15例,其中男10例,女5例,年龄6~14岁,平均年龄9.0±1.8岁,受伤部位均为额叶。
1.1.1脑组织来源及分组15例脑挫裂伤患儿中,取8例重型颅脑外伤后患儿脑组织,其中男6例,女2例,年龄为6~14岁,平均年龄9.0±1.6岁, 受伤部位均为右额叶。GCS评分为5~8分,血肿均由CT或MRI检查证实。另选取3例脑室肿瘤患儿为对照,在行肿瘤切除术过程中取得正常额叶皮层组织。部分标本在切除后立即置液氮中保存,供蛋白质检测;另一部分标本经4%多聚甲醛固定18h,常规脱水、石蜡包埋、4μm连续切片,供免疫组化检测。
1.1.2血清来源及分组采集所有患儿手术前、仅经一般治疗后的血清(选取病例的伤后时间相对固定)用于ELISA分析。正常人血清由年龄和性别匹配的10例志愿者提供。标本的获取均经患儿家长同意并签署知情同意书。
1.2试剂与仪器Ngb酶联免疫检测试剂盒(Sigma公司);大鼠抗Ngb多克隆抗体(美国SantaCruz公司);生物素二抗(美国SantaCruz公司);辣根过氧化物酶偶联的羊抗大鼠(美国SantaCruz公司);正常封闭血清、DAB显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司);PVDF膜(Millipore公司);SP免疫组化试剂盒(迈新生物公司);磷酸、甘油、乙醇、EDTA二钠为国产分析纯。IPGphor 等电聚焦仪、EttanDALTⅡ垂直电泳槽及ImageScanner扫描仪均为美国AmershamBio-sciences公司产品;MicroQ-TOF质谱仪为美国Wa-ters公司产品;石蜡自动包埋脱水机及石蜡自动连续切片机为德国Leica公司产品;混匀仪为美国 Thermo公司产品;Multiskanspectrum型酶标仪为美国热电公司产品;AmershamEPS301型水平式电泳槽为美国 PharmaciaBiotech公司产品;Alphamager2200型凝胶成像系统为美国AlphaInnotech公司产品。
1.3方法
1.3.1脑组织总蛋白的提取参照Araki等的方法将处理过的标本取出,置于研磨管中,加入0.2mL组织裂解液在冰上将组织磨碎,4℃下12000r/min离心60min。取5μL上清液用于蛋白质浓度测定,剩余上清液冻存于-80℃备用。
1.3.2二维凝胶电泳操作步骤按照IPGphor等电聚焦系统使用指南进行。组织总蛋白提取物与水化液混合至总体积为450μL蛋白质样本,置于 IPGphor等电聚焦仪上,按如下条件:30V水化14h后经500V1h、1000V1h、8000V10h进行等电聚焦。等电聚焦结束后,分别于 10mL平衡A液和平衡B液中各平衡15min,转移至12.5%SDS-PAGE胶上端,在垂直电泳槽上进行第二向垂直电泳。电泳结束后,对2-DE胶进行考马斯亮蓝染色。实验重复3次。
1.3.3凝胶图像分析应用ImageScanner扫描仪扫描考马斯亮蓝染胶,并运用LabScan扫描软件获取图像,PDQuest2-DE软件比较分析对照组儿童和脑挫裂伤患儿脑组织蛋白二维电泳图谱的差异,选取表达水平相差2倍以上的蛋白质点进行质谱分析。
1.3.4质谱分析参照李美香等的方法,将萃取后冻干的样品用萃取工作液约4μL溶解,用Tips反复在样品液中吸进压出循环操作,充分混匀后取 0.6μL点于点样板上,再加0.6μLCCA基质工作液置空气中自然风干。肽段样品用MALDI-TOF-MS检测,质谱检测是在正离子反射模式中进行,N2激光源,波长337nm,飞行管长3m,加速电压20kV,反射电压23kV。质谱使用基质峰和胰酶自动降解离子峰作为内部标准校正。
1.3.5免疫组织化学染色采用SP法,按照北京中杉金桥生物技术有限公司提供的SP试剂盒说明书进行。然后进行切片、脱蜡及水化、漂洗及蒸馏水洗涤、微波修复、加入一、二抗孵育、光镜下观察、苏木素复染、树胶封片、光镜下观察切片染色情况并拍照。染色结果判定:Ngb蛋白的表达以细胞浆内出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞。采用双盲法,按以下标准进行半定量分析:每张切片至少观察5个高倍视野,不少于100个细胞,将各视野中阳性细胞的平均百分数作为该切片的阳性细胞百分比进行记分:0%~5%=0分,6%~25%=1分,26%~50%=2分,51%~75%=3分,>75%=4分。染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准记分:细胞未着色为0分,染色呈淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。最后以阳性细胞的百分比和染色强度记分之和进行结果判定,0~1分为阴性(-),2~3分为弱阳性(+),4~5分为中度阳性(2+),6~7分为强阳性(3+)。用PBS溶液代替Ngb抗体作阴性对照,用已知阳性表达的脑外伤组织作阳性对照。
1.3.6血清样品的制备及Ngb浓度测定采集健康儿童和脑挫裂伤患儿空腹静脉血5mL,室温下凝固待血清析出,2000r/min,4℃离心 15min,取上层血清,分装后-80℃冰箱保存。血清Ngb的检测严格参照试剂盒说明书进行,通过标准品浓度和其吸光度值绘制标准曲线,然后计算各样本的Ngb浓度。
1.4统计学分析应用SPSS15.0统计软件包进行统计学分析。各组数据采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采取独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1脑组织双向凝胶电泳图谱在同等条件下对同一标本的总蛋白质样品分别进行了3次双向凝胶电泳,其总蛋白质的分布模式非常相似,以pI4~8和 Mr20~75kD范围的蛋白质斑点分布最多。经过优化的2-DE条件获得了分辨率高、背景清晰的双向凝胶参考图谱。见图1。
