胶束电动色谱法对植物物种中桃叶珊瑚甙和梓醇的测定

胶束电动色谱法对植物物种中桃叶珊瑚甙和梓醇的测定

    胶束电动色谱（MEKC）是用来分离和测定2-环烯醚萜甙的，桃叶珊瑚甙和梓醇存在于一些生长在克罗地亚的植物物种中，如：洛矶山圆柏属，银链盒属，肾果荠属，硬骨草属 (环境问题科学委员会) ，雷鸟属，杉木属和海栖属。热水萃取（HWE）是用于分离环烯醚萜物质的。显著的差异出现于审查的物种中的环烯醚萜部分。干质量的叶子中的桃叶珊瑚苷和梓醇的产量分别增加了0.27 ％和1.81 ％ 。此外桃叶珊瑚甙和梓醇这两个相关的化合物，可以在该植物样品中确定了。

关键词：植物，胶束电动色谱法，环烯醚萜甙，梓醇

导言

    该属植物的组成包括265种，并已大都作出了分布。按医药界上说法，它们是收敛剂 ， 缓和剂 ，润肤剂， 除痰剂 ，利尿剂，抗菌药物和抗病毒药物。近几年，相当多的不同的环烯醚萜已从该属的植物中分离出来，这包括桃叶珊瑚甙，梓醇，和生物合成的相关化合物。
 环烯醚萜类是植物中自然产生的单萜产品，可分为4个组：环烯醚萜甙，苷元和非糖苷环烯醚萜类，开环异落叶松树脂酚。环烯醚萜类的产生在以下学科中已详细讨论过：爵床科，唇形科，车前科 ，茜草科和玄参科。对环烯醚萜的强大兴趣已被相对广泛的生物活性所引发。并且利用它们作为在植物分类学中的标记。植物提取物中含有几种具有生物活性的化合物,在它们的复杂混合物当中，环烯醚萜甙 ,桃叶珊瑚甙还有梓醇可以作为分析标记，以确定不同来源的提取物的质量。
    环烯醚萜类通常被从用溶剂浸渍的样品中分离析出，主要的溶剂就是甲醇或乙醇。索米等人表明，提取方法不同于它们从维罗妮卡长叶叶片中提取桃叶珊瑚甙和梓醇的工作效率。最好的结果是可以使用100°C和标准大气压力的热水萃取（ HWE ）。用这个方法提取的桃叶珊瑚苷和梓醇标准化合物可达到90％以上。桃叶珊瑚甙和梓醇质量分数（ ％环烯醚萜/干质量）至少2倍高于确定后的甲醇，乙醇和2—丙醇的提取物。该HWE技术，也展示了更好的可重复性，比传统的分离技术更加的环保。
 环烯醚萜苷的典型特征是，部分氢化物融合环戊烯- [c]吡喃系统，其中源自内乙缩醛二乙醇的一个1,5 - 环戊烷二醛基元，通常是通过缩醛化或酯化反应来稳定的。由于环烯醚萜类先是水解，随后就立即重新排列，所以即使是在轻度酸性条件下，所有的分析都必须在基本的缓冲解决办法下被执行。在毛细管电泳法中基本的条件是一个优势，因为电渗流增加，因此组分的迁移时间，以及总分析时间就会减少。只有极少数的关于用毛细管电泳法（ CE ）分析环烯醚萜的报告已被出版。据他们说，几环烯醚萜苷可以用胶束电动色谱法成功分离 。这种做法的优势在于可快速分析，满意的解决环烯醚萜以及由其余的样本分离的部分之间的关系。
    本研究的目的是要确定适用胶束电动色谱方法的几个植物物种的提取物中，桃叶珊瑚甙和梓醇（图一）的内容。就以桃叶珊瑚甙和梓醇含量来说，这方面的植物物种的研究工作还尚未进行过定量分析，除了披针叶黄华这种植物，这是作为一个参考标本来做的。

        
 （ 1 ）                                （ 2 ）
 
 图.1 。桃叶珊瑚甙（ 1 ）和梓醇（ 2 ）的结构 。

材料与方法

植物材料

    日益增长的野生植物物种包括：臭椿属，银链盒属, 臭芥属，硬骨草属，洛矶山圆柏属，雷鸟属，杉木属和海栖属。于2000年6月，在属于克罗地亚的伊斯特利亚和茨雷斯群岛收集。所有的植物样本已被Ivan Sˇ ugar教授确定过了（药用植物学部分,药剂业及生物化学， 萨格勒布大学，克罗地亚） 。凭证标本（编号0061-0069 ）存放在了该生药学的标本部（医学院药剂业及生物化学,萨格勒布大学，克罗地亚） 。老叶的风干样品也被进行了研究。

标准及试剂

    桃叶珊瑚甙和梓醇的标准是Siren Rosendal Jensen博士捐赠的（技术大学， 宁比 ，丹麦） 。该化合物是用乙醇从植物材料中提取出来的，用反相高效液相色谱法进行纯化，并在波长为206和254 nm时由紫外检测所确定。权衡标准的物质被溶解于水中。为了提高分析方法的准确性，桃叶珊瑚甙和梓醇的浓度水平的三种标准被分别确定了（ 0.05, 0.075和0.1毫克/毫升） 。二钠十水合物硼酸（十水硼砂）和氢氧化钠可从亚硒酸钠乳化剂中获得（萨格勒布，克罗地亚） ，而十二烷基硫酸钠（ SDS ）则由默克获得（达姆施塔特.德国）。实验中使用的水是具有明确规定的双重蒸馏和去离子水。最后得到的水的电阻应为18Mω 。

样品制备

   粉叶材料（ 200毫克） ，称量精确性要达到0.1毫克。在此之后， 由热水萃取（ HWE） 。样本被放到小瓶中称量，其余的部分用纯净水来补充。混合物被保存在室温下40分钟，以彻底润湿样品，然后在加热套上加热至100 °C，保持60分钟。该提取物被蒸发以达到干燥，然后在水和乙醚之间进行分离。由于环烯醚萜甙是高度极性化合物，乙醚一环烯醚萜类化合物都不会提取到。水相过滤，水被加入到4毫升的样品中。样品准备两份，并注射了两次。
之前分析中，所有标准和样品的处理方法，就是通过水浴无菌过滤器进行筛选，孔径为0.20 μm。

仪器和分析程序

    3DCE（惠普， 纽约:阿旺达尔 ，私人助理 ，美国） ，毛细管电泳系统，配备了紫外/可见二极管阵列检测器使用。非涂布二氧化硅毛细血管供应复合金属材料。毛细管的总长度是35厘米，而相对有效的长度为26.5厘米。内部和外部直径分别为50和375 μm。
 测定环烯醚萜甙的最合适的设置条件是用MEKC方法，包括50 mmol / L的硼酸和180
mmol / L的SDS组成的电解质，调pH至9.35 ，波长的200e 2 nm和250 e 30 nm时，十千伏电压，电流80 μA，以及50 mbar ￥5 s注射液和镭射温度25º c。预处理有所改变，相比于索米等人描述的数据方法，预处理是有点改变 。而不是一个8分钟用含电解质的水冲，一个3分钟直接用水冲洗。经过连续6次运行就可以了，其运行内容是由10分钟的0.1 mmol / L的氢氧化钠冲水和20分钟电解质的冲水构成，而随后进行了15分钟的电泳运行。
 补充电解质的小瓶被使用了。介绍这些变化，是为了使分析变得简单和持续。

结果与讨论

    由于复杂的植物材料和结构相似的环烯醚萜甙， MECK被选为分开这些化合物的方法.这个方法被发现对各种植物物种中的桃叶珊瑚苷和梓醇的分离及定量分析是很有效率的。
    对于分离植物提取物中的桃叶珊瑚苷和梓醇,第一种选择就是薄层色谱（ TLC ）。薄层色谱法还是有一些问题的。一些在植物样品中的桃叶珊瑚甙和梓醇的相关化合物，目前是不易从分析化合物中脱离的，这可能导致虚假数据的出现。高效液相色谱法（ HPLC ）没有考虑到由于其长期的运行时间,伤损可作为一个单独的峰来解决环烯醚萜类的问题。这些因素导致了毛细管电泳（ CE ） 。由于桃叶珊瑚甙和梓醇有很高的pKa值（ > 12 ） ，这些分子都是非离化(合)键，不能把它们由常规的毛细管电泳法（CZE）分开，因此，十二烷基硫酸钠（ SDS ）可被用来作为电解质溶液中胶束形成的物质。高胶束浓度分别需要单独的与他们结构类似的桃叶珊瑚甙和梓醇。
    为了改善桃叶珊瑚甙和梓醇峰之间的分离，一个稍长毛细管被用于对比先前报道的方法。替换掉33.5厘米，使用一个35厘米的总长度，恒电流限制为80 μA。注射量没有减少，因为这会降低该方法的灵敏度。最终解决组分之间问题的却是反对称最小二乘解的算法，这是用切线的方法来做的衡量。缺点是一个12分钟的稍长的运行时间。对提到的桃叶珊瑚甙和梓醇中的有关问题，是用这种方式来解决的（图2 ） 。图三表明，这种方法也可用于指纹图谱分析。灵敏度的改善是通过降低探测器的响应时间2.6 s所取得的 ，以及狭窄的主要信号带宽（±2 nm ） 。双组分的较慢的迁移时间增加了灵敏度。有点低的电流限制造成较慢的分析迁移，而这又反过来引起峰面积的增加，但无显着的高峰扩大。信噪比为0.05毫克/毫升，桃叶珊瑚甙的浓度为150, 梓醇的浓度为102。这表明双方定量限额分别为5毫克/升或更少。

Fig. 2. Electropherogram of iridoid substances 1D4 in Plantago lanceolata L. 1, Iridoid related substance No. 1;2, catalpol; 3, aucubin; 4, iridoid related substance No. 2.MEKC conditions: uncoated silica capillary, 50 μm i.d. ￥35 cm; running buffer, 180 mmol/l SDS and 50 mmol/l borate (pH = 9.35); separation voltage, 10 kV; current,80 μA; injection, 50 mbar ￥ 5 s; wavelengths, 200 e 2 nm and 250 e 30 nm; cassette temperature, 25 ºC.
。

Fig. 3. Electropherogram of a Plantago argentea Chaix aqueous extract. 1, Iridoid related substance No. 1; 2, catalpol;3, aucubin. MEKC conditions are the same as in Fig. 2.

Table I. Aucubin and catalpol contents in Plantago species.

 Sample name  Aucubin                               Catalpol
 Average    Standard    LCLa      UCLb               Average    Standard    LCLa      UCLb
yield (%)   deviation   (0.05%)   (0.05%)       yield (%)   deviation   (0.05%)   (0.05%)
P. altissima  0.092      0.001     0.090    0.094           0.131      0.001     0.127    0.135
P. argentea  0.273      0.004     0.267    0.278           1.809      0.031     1.767    1.852
P. coronopus  < LODc                                                        < LODc
P. holosteum subsp.  0.077      0.007     0.068    0.086          < LODc
 depauperata 
P. holosteum subsp.  < LOQd                                                         < LODc
 holosteum 
P. holosteum subsp.  < LOQd                                                         < LODc
 scopulorum 
P. lagopus  0.072      0.007     0.063    0.082            0.082     0.002     0.079    0.085
P. maritima  0.027      0.003     0.021    0.034          < LODc
P. lanceolata  0.115      0.010     0.098    0.132            0.159     0.001     0.152    0.166
a Lower confidence limit.
b Upper confidence limit.
c Limit of detection.
d Limit of quantification.

  通过描述的分析方法所取得的成果，表现出在研究的物种间的桃叶珊瑚甙和梓醇的内容的变化.依据样本，桃叶珊瑚甙产量高达0.27 ％ ，而梓醇的百分比则高达0.16 ％ ，除了在P. 鸡冠花中，它含有1.81 ％的环烯醚萜（表一） 。在所有被分析的含有环烯醚萜检测上限的提取物中（ LOD值） ，桃叶珊瑚甙在目前和梓醇相比则是更加频繁。只有臭荠属 桃叶珊瑚甙的样本是不用遵守的。除了臭荠属，还有硬骨草属，亚.硬骨草属和亚种, 洛矶山圆柏中并不含有大量的关于环烯醚萜的任何分析。在两种都出现的在所有情况下，梓醇的含量普遍高于桃叶珊瑚甙的含量。这可能与植物代谢途径及其动力学有关，虽然它可能也是不同的萃取回收率的一个后果。
 用描述的分析方法可以成功地从样品组成中分离出环烯醚萜类物质（图2 ） ，在大多数样品中发现的两个未知峰，是可以被分配到环烯醚萜类中的有关物质。它也表明未知峰1号的紫外光谱对应的是梓醇的紫外光谱，而未知峰第2号对应的则是桃叶珊瑚甙的紫外光谱，用苯初馏处理制备的样品既不会分解，也不修改桃叶珊瑚甙和梓醇的结构。这被包括的一个控制运行证实了，以及通过采用相同的程序来表演的树叶和标准物质。另外，为避免可能的分配错误 ，所有峰的相对留存额（RRt）被进行了使用。未知环烯醚萜相关物质的第1号（RRt = 1.28 ） 是目前在所有的样品，而未知物质第2号（RRt = 1.54 ） 也没有在臭椿属 ，银链盒属和十字花科臭荠属中被发现 。此外，也有一些样本包含三个甚至四个高峰，其中两次是桃叶珊瑚甙和梓醇，而在十字花科臭荠属，桃叶珊瑚甙和梓醇的叶片中并未检出，但也只是未知的环烯醚萜物质的第1号（Rt= 8.240分; RRt = 1.28 ） 。这不包括可能性的分配错误。
    所述分析方法已成功用于在不同植物物种中分离和测定环烯醚萜物质。这种方法操作简便，既可靠又高效率，非常低的调查化合物的定量界限则是其特征。 MEKC在指纹图谱的分析上也可以被用来作为一种宝贵的工具。
鸣谢

 The authors would like to thank to Dr. Siren Rosendal Jensen for the iridoid standards, and to Goran Srecˇnik for technical support and useful suggestions.

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