瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究
资料包括： 论文(4页3213字)
说明：
目的 观察钙网蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情况。方法 采用免疫细胞化学染色和原位ELISA技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞进行CRT分布定位及表达水平研究。结果 瘢痕和正常皮肤成纤维细胞在处于增殖生长状态时，胞浆及核内均有不同程度的CRT表达，其中瘢痕成纤维细胞表达CRT水平(A:1.97±0.15,ELISA492nm)明显高于正常皮肤成纤维细胞水平(A:1.43±0.12),差异有非常显著意义(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内则均无CRT表达。结论 瘢痕成纤维细胞内CRT的丰富表达对促进细胞迁移、信号传递及钙存储等方面均有着积极作用。
Study on the expression of calreticulin in hypertrophic scar-derived fibroblasts
【Abstract】Objective To investigate the expression level and intracellular distribution of calreticulin(CRT) in hypertrophic scar-derived fibroblasts(HSF)and normal skin-derived fibroblasts(NSF).Methods Using anti-CRT antibody, CRT was detected in HSF and NSF by immunocytochemistry and ELISA technique.Results CRT was present in the cytoplasm and nuclei in proliferating HSF or NSF in culture, but HSF possessed significantly higher expression level of CRT than NSF(P＜0.01). When these cells (HSF and NSF) were fused , neither intracellular nor intranuclear staining for CRT was observed.Conclusion In HSF and NSF,the distribution of CRT is widespread. Because of its abundant expression in HSF, we postulate that CRT as a multifunctional protein plays an important role in Ca2+ sequestering, integrin-mediated signalling and cell adhesion.
【Key words】 Hypertrophic scar Fibroblast Calreticulin Expression
增生性瘢痕(Hypertrophic scar, HS)作为创伤及外科手术后常见且十分棘手的皮肤组织疾病，瘢痕组织内成纤维细胞异常活化和细胞外间质过度沉积既是HS的重要组织学特征，也是HS发生、发展的物质基础。钙网蛋白(Calreticulin, CRT)最早是作为一种存在于非肌细胞内质网上的主要钙结合蛋白得以认识的［1］，近几年的研究发现：除具有钙离子储藏作用外，CRT在参与并调节众多细胞生物学活性功能上有着积极影响［2-5］，同时它还作为自身抗原在某些免疫性疾病的发病机制中有着极其重要的价值［6］。我们通过CRT抗体并利用原位ELISA及免疫细胞化学染色技术检测瘢痕成纤维细胞体外表达CRT水平，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照，探讨CRT在瘢痕成纤维细胞发挥异常生物学活性功能中的作用。
1 材料与方法
1.1 组织标本
增生性瘢痕及正常皮肤组织标本均取自住院病人，年龄17～40岁。患者在取标本前无长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史，不伴肿瘤及其他严重疾患；瘢痕组织生长时间均在6～9个月之间。
1.2 主要试剂及物品准备
羊抗CRT抗体：Michalak博士惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。细胞培养基：DMEM添加10%小牛血清(上海华美生物技术有限公司)。96孔塑料培养板及100mm培养皿(丹麦Nunc公司)。
1.3 成纤维细胞培养
手术切取增生性瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗10min，PBS洗3次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量10%小牛血清的DMEM培养基，37℃5%CO2静止培养，3天后补充少量培养剂，隔2天换液，见有细胞从组织块爬出生长后每天换液，传代。
1.4 CRT免疫细胞化学染色
体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗体37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反应1h，DAB显色；显微镜下观察显色信号。
1.5 CRT原位ELISA检测［7］
选择第5代培养细胞为实验对象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至106/ml，每孔100μl接种于96孔培养板内。培养16h后，去培养剂，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS洗；与0.1%Triton X-100 4℃作用3min后，进一步分别与5%小牛血清(37℃、20min)、抗CRT抗体(37℃、1h)、5%小牛血清PBS稀释的HRP-兔抗羊IgG(37℃、1h)反应；PBS清洗后加入OPD底物液100μl，作用30min后用50μl1mol/L硫酸中止反应。ELISA reader 上读取492nm的P值。
2 结果
2.1 成纤维细胞初代培养结果
在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种后2天见有部分贴壁，培养1周后有少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出，2周后细胞在组织块周围呈晕状分布，此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态，发现细胞均呈细小梭形状，二者未见明显差异。
2.2 成纤维细胞CRT表达的免疫细胞化学染色结果
原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在未生长融合前，细胞内均有不同程度的CRT阳性表达；一旦细胞生长融合后，在融合区内的成纤维细胞中均未见有明显的CRT阳性信号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内，则仍有CRT的阳性信号分布；就二种细胞内 CRT的表达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的CRT阳性信号相对较强，而正常皮肤成纤维细胞内CRT阳性信号相对较弱；另外，当瘢痕及正常皮肤成纤维细胞以较高密度传代培养时，细胞内CRT表达在接种后16h较为明显，而在培养24h细胞接近融合时信号较弱。
此外，CRT在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细胞浆、核膜及核内均有表达。
1 材料与方法
2 结果
3 讨论
参考文献：
1 Krause KH, Michalak M.Calreticulin. Cell, 1997, 88:439-443.
2 Tector M, Zhang Q, Salter RD. Beta 2-microglobulin and calnexin can independently promote folding and disulfide bond formation in class I histocompatiblity proteins. Mol Immunol, 1997, 34:401-408.
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11 赵烨德，何清濂，纪徐淮，等.瘢痕成纤维细胞整合素表达实验研究.第二军医大学学报，1998，19：330-332.
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