脐带血NKT细胞的体外扩增及其表型研究
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说明：
【摘要】 目的 建立体外有效扩增脐带血NKT细胞的方法及其表型的研究。方法 分别采用单加IL-2，及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺（α-Galcer）的方法，从人脐带血单个核细胞（UCB-MNCs）中扩增NKT细胞。用流式细胞检测技术测定NKT细胞（TCR Vα24+ TCR Vβ11+）的比例及其他表型特征。结果 UCB-MNCs在第7天时，其TCR Vαβ+ NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的（24.48±4.19）%，是原来的（8.74±4.37）×102倍 （ P＜0.01），且大多不表达NK1.1（CD161）；TCR Vβ11+较TCR Vα24+高表达。结论 α-Galcer对脐血NKT细胞有特异地扩增功能。以表型划分，脐血中的NKT细胞多为NK1.1-，一种新的NKT细胞亚型。
【关键词】 脐带血；NKT细胞；α-Galcer；细胞表型
The proliferation of natural killer T cells in umbilical cord blood and the different phenotype between them
【Abstract】 Objective The first objective of this study was to establish an effective method to proliferate natural killer T （NKT） cells in umbilical cord blood （UCB）.The second one was to study the phenotype.Methods Mononuclear cells （MNCs） from UCB were cultured in the presence of IL-2 （100U/ml），with or without alpha-galcer.TCRValpha24Vbeta11 double positive NKT cells and its other phenotypes were determined by flow cytometry.Results After 7 days expansion，TCRVαβ+ NKT cells from UCB-MNCs increased（8.74±4.37）×102 times，but most of them did not express NK1.1 and its TCR Vβ11+ was higher than TCR Vα24+.Conclusion Human TCRValpha24Vbeta11 double positive NKT cells can expand following the administration of alpha-galcer.Most of the UCB-NKT was NK1.1-，a new subset of NKT cells.
【Key words】 umbilical cord blood；natural killer T （NKT） cells；alpha-galcer；phenotype
脐带血是一种来源广泛的新资源，其中的低免疫原性细胞正日益受到人们的关注。近研究发现，构成机体免疫系统的淋巴细胞中，除T、B、NK细胞外，还存在一种新的细胞系—NKT细胞。这种细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应，抑制GVHD的发生。但是，NKT细胞在脐血中的含量极少，很难用于临床研究和治疗。本文拟探讨一种高效的体外扩增脐血NKT细胞的方法，并同时分析它的表型特征，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 Ficoll-Paque细胞分离液（Phamarcia公司）；12孔细胞培养板（Corning公司）；RPMI1640培养基（Gibico公司）；KRN7000（αlpha-galactosylceramide，简称α-Galcer，日本麒麟公司惠赠，100ng/ml）；IL-2（R&D公司）；PE标记的TCR Vα24、CD161及FITC标记的TCR Vβ11单克隆抗体（Immunotech公司）；6%羟乙基淀粉生理盐水溶液（B.Braun公司）；EPICS ELITE ESP型流式细胞仪（Beckman-Coulter公司）。
1.2 方法
1.2.1 脐带血单个核细胞（UCB-MNCs）的制备 新鲜采集的正常人脐带血以ACD-B抗凝血袋收集，继以体积比4：1加入6%HES液中，吹打均匀后4℃下静置1h，吸取中间白膜层用0.6%ACD-PBS对倍稀释，混匀后以2：1的比例加入Ficoll上层，离心（2000rpm，20min），取中间细胞环，PBS洗3次，悬浮于含10%FCS的完全培养液中。
1.2.2 脐带血中NKT细胞的扩增 将新鲜分离的UCB-MNCs接种于含10%FCS完全培养液的12孔细胞培养板中，每实验孔接种密度为5×105/ml，分设实验组MNCs+ IL-2（5u/ml）和MNCs+α-Galcer（100ng/ml）+ IL-2（5u/ml），并以MNCs单独培养作为空白对照组。37℃，5%CO2及饱和湿度的条件下培养。
1.2.3 形态观察 双相倒置显微镜，每12h观察细胞形态1次。
1.2.4 NKT细胞的含量及表型检测 吸取100μl培养的细胞，各加入20μl PE标记的TCR Vα24、CD161及FITC标记的TCR Vβ11单克隆抗体，避光孵育15 min，加入0.5ml PBS，做双荧光检测，测定第7天和第14天TCR Vα24+ Vβ11+ NKT细胞含量及其他表型特征。
1 材料与方法
2 结果
3 讨论
参考文献：
1 Hammond KJ，Poulton LD，Palmisano LJ，et al.alpha/beta-T cell receptor （TCR）+CD4-CD8- （NKT） thymocytes prevent insulin-dependent diabetes mellitus in nonobese diabetic （NOD）/Lt mice by the influence of interleukin （IL）-4 and/or IL-10.J Exp Med，1998，187：1047-1056.
2 Wilson SB，Kent SC，Patton KT，et al.Extreme TH1 bias of invariant V alpha 24J alpha Q T cells in type 1 diabetes.Nature，1998，391（6663）：177.
3 Zeng D，Lewis D，Defbakhsh-Jones S，et al.Bone marrow NK1.1（-） and NK1.1（+） T cells reciprocally regulate acute graft-versus-host disease.J Exp Med，1999，189（7）：1073.
4 Ueda Y，Hagihara M，Gansuvd B，et al.The effects of alphaGalCer-induced TCRValpha24 Vbeta11（+） natural killer T cells on NK cell cytotoxicity in umbilical cord blood.Cancer Immunol Immunother，2003，52：625-631.
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