甘草酸差向异构体分离分析与稳定性研究
资料包括： 论文(20页11205字)
说明：
摘 要：甘草酸(glycyrrhizic acid，GL)是豆科（leguminosae）植物甘草（Radix Et Rhizoma Glycyrrhizae）的主要活性成分，为差向异构体。甘草中甘草酸以α体和β体两种构型存在，在一定条件下相互转化。本文对α-甘草酸和β-甘草酸的同时含量测定方法和稳定性进行了研究。
本研究采用半制备液相色谱分离技术，对α,β-甘草酸二铵原料药和β-甘草酸铵原料药进行分离纯化，制备得到α-甘草酸和β-甘草酸的对照品，为进一步研究提供了物质基础。
本研究首次建立了α-甘草酸和β-甘草酸在甘草药材中同时含量测定的高效液相色谱法。采用Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm i.d, 5 m )，流动相为甲醇-1 %醋酸水(6634, v/v)，检测波长为250 nm，流速为1.0 mL•min-1，柱温为35 °C。α-甘草酸和β-甘草酸的线性范围分别为0.010 44～0.208 8mg•mL-1(r = 0.999 5)和0.051 88～1.038 mg•mL-1(r = 0.999 6)。平均回收率(n = 9)分别为99.7 %和99.4 %，RSD(n = 9)分别为2.1 %和2.3 %。采用本研究方法，对19批样品中的甘草酸差向异构体进行了含量测定，除河北Ⅰ产地外其他产地α-甘草酸和β-甘草酸的含量总和都大于2 % 。β-甘草酸与α-甘草酸的比值都在13:1左右。
本研究首次建立了α-甘草酸二铵和β-甘草酸二铵在甘草酸二铵注射剂中同时含量测定的高效液相色谱法。采用Ultimate XB- C18柱(250 mm×4.6 mm i.d, 5 m )，流动相为甲醇-1 %醋酸水（6040 v/v），流速为1.0 mL•min-1，柱温为35 °C。α-甘草酸和β-甘草酸的线性范围分别为0.010 92～0.218 4mg•mL-1（r = 0.999 8）和0.005 188～0.103 8mg•mL-1（r = 0.999 8)。平均回收率（n = 9）分别为98.5 %和99.1 %，RSD（n = 9）分别为2.4 %和2.1 %。采用本方法，对3批样品进行了测定，结果表明甘草酸二铵注射剂中α-甘草酸和β-甘草酸的含量都较大。本方法简便，结果准确，重现性好。
甘草酸在甘草中以α体和β体共存，在一定条件下相互转化。但转化条件并无报道。本研究考察了甘草提取、浓缩及干燥过程中的提取时间和加热温度对α-甘草酸和β-甘草酸稳定性的影响，同时还考察了放置时间和光照对α-甘草酸和β-甘草酸对照品稳定性的影响。
结果表明，甘草药材提取过程中α体和β体不相互转化，但随着提取时间的增长，两者峰
面积逐渐下降；不同温度下甘草提取液中α体和β体含量稳定不变。放置时间和光照使甘草酸差向异构体混合对照品（β体α体 = 261）峰面积略有改变，存在α体向β体缓慢转化的趋势，两者达到331共存。
关键词：α-甘草酸，β-甘草酸，差向异构体，含量测定，稳定性
前言
1.1甘草酸的研究概况
甘草(Radix Et Rhizoma Glycyrrhizae)为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.，胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎 。甘草味甘，性平。有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹，四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。目前国内外已从甘草中分离得到100多种黄酮类化合物，60多种三萜类化合物以及香豆素类、18种氨基酸、多种生物碱、有机酸等。
甘草酸(glycyrrhizic acid，GL)是甘草中最主要的活性成分，其钾、钙盐为甘草甜素(glycyrrhizin)，水解后产生二分子葡萄糖醛酸(glcuronic acid)和一分子18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid)。甘草中甘草酸以α体和β体（化学结构式见Fig.1-1）两种构型存在，在一定条件下相互转化。GL具有多种药理活性，临床广泛用于抗炎和保肝解毒等。对甘草酸的研究、开发日益受到国内外的重视。
ABSTRACT
glycyrrhizic acid is the main active ingredient of Radix Et Rhuzoma Glycyrrhizae,which is epimer.There are α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid in nature and they can transform each other. The present study provides a method to determine the epimer of glycyrrhizic acid in Radix Et Rhuzoma Glycyrrhizae and Diammonium Glycyrrhizinate Injection by high performance liquid chromatography. Besides, α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid are studyed on the Stability.
(1) The standards of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid are isolated from the crude drugs of Diammonium Glycyrrhizinate and Ammonium Glycyrrhizinate by Semi-preparative chromatography.
(2) The present study provides a method to stimultaneous determine of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid in Radix Et Rhuzoma Glycyrrhizae on the the first time. The chromatographic condition included a Hypersil C18 column (250 mm×4.6 mm i.d, 5 m ) and the mobile phase consisting of Methanol-1 % acetic acid aqueous (66:34, v/v) and the absorbance was monitored at 250 nm.The calibration curve were linear over the range of 0.010 44～0.208 8 mg•mL-1（r = 0.999 5）and 0.051 88～1.038 mg•mL-1（r = 0.999 6）respectively .the mean recovery (n = 9)were 99.7 % and 99.4 % respectively and the RSD(n = 9) were 2.1 % and 2.3 % respectively .19 batches of Radix Et Rhuzoma Glycyrrhizae were analyzed under the same chromatographic condition.The results indicated that the cotents of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid are different very much in Radix Et Rhuzoma Glycyrrhizae, but the ration of β-glycyrrhizic acid and α-glycyrrhizic acid’s cotents almost about at 13:1.
(3) The present study provides a method to stimultaneous determination of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid in Diammonium glycyrrhizinate injection on the the first time. The chromatographic condition included a Ultimate XB- C18 column (250 mm×4.6 mm i.d, 5 m ) and the mobile phase consisting of Methanol-1 % acetic acid aqueous (60:40, v/v) and the absorbance was monitored at 250 nm.The calibration curve were linear over the range of 0.010 92～0.218 4 mg•mL-1（r = 0.999 8）and 0.005 19～0.103 8mg•mL-1（r = 0.999 8) respectively . the mean recovery (n = 9）were 98.5 % and 99.1 % respectively and the RSD(n = 9) were 2.4 %
and 2.1 % respectively .3 batches of Diammonium glycyrrhizinate injection were analyzed under the same chromatographic condition.The results indicated that there are lots of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid in Diammonium glycyrrhizinate injection. The assay was found to be simple and accurate to measure the concentrations of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid in Diammonium glycyrrhizinate injection.
(4) α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid transformed each other under the certain conditions.The pretent study provided that the Stability of α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid during the process of extracting Radix Et Rhuzoma Glycyrrhizae and the Stability of their standards under the conditions of Light and ambient temperature. The results indicated that α-glycyrrhizic acid and β-glycyrrhizic acid can not transform each other during the process of extracting Radix Et Rhuzoma Glycyrrhizae, but their peak areas gradually decreased with the increasing of time. Their peak area do not transform significantly in the extenion of Radix Et Rhuzoma Glycyrrhizae under different temperatures.The peak area of β-glycyrrhizic acid gradually decreased and transformed to α-glycyrrhizic acid under the conditions of Light and ambient temperature,and they coexisten stably on the ration of 33:1.
Key Words: α-glycyrrhizic acid;β-glycyrrhizic acid;epimer;determination;Stability
前言
1.1甘草酸的研究概况
甘草(Radix Et Rhizoma Glycyrrhizae)为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.，胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎 。甘草味甘，性平。有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹，四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。目前国内外已从甘草中分离得到100多种黄酮类化合物，60多种三萜类化合物以及香豆素类、18种氨基酸、多种生物碱、有机酸等。
甘草酸(glycyrrhizic acid，GL)是甘草中最主要的活性成分，其钾、钙盐为甘草甜素(glycyrrhizin)，水解后产生二分子葡萄糖醛酸(glcuronic acid)和一分子18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid)。甘草中甘草酸以α体和β体（化学结构式见Fig.1-1）两种构型存在，在一定条件下相互转化。GL具有多种药理活性，临床广泛用于抗炎和保肝解毒等。对甘草酸的研究、开发日益受到国内外的重视。
摘 要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
ABSTRACT••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••4
第一章 前 言•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••6
1.1甘草酸的研究概况••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••6
1.2甘草酸的药理作用••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••7
1.3差向异构体简介•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8
1.4 立题依据和研究思路•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8
第二章 甘草酸差向异构体对照品的制备••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••10
2.1 α-甘草酸对照品的制备•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••10
2.2 β-甘草酸对照品的制备••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
2.3 小结•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••13
第三章 甘草酸差向异构体的含量测定方法研究••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
3.1甘草药材中甘草酸差向异构体的同时含量测定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
3.2 甘草酸二铵注射剂中甘草酸二铵差向异构体的同时含量测定••••••••••••••••••••••••••••••••••25
第四章 甘草酸差向异构体的稳定性研究••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••32
5.1 甘草药材中甘草酸差向异构体的稳定性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••33
5.2 甘草酸差向异构体对照品的稳定性••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••35
第七章 结果与讨论••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••40
参考文献••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••42
发表文章••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••45
致 谢•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••46
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作者点评：
1. 本研究采用半制备液相色谱分离技术，对α,β-甘草酸二铵盐原料药和β-甘草酸单铵盐原料药进行分离纯化。由于α体和β体在一定条件下相互转化，对半制备液相分离得到的组分进行减压浓缩干燥时选择了低温避光操作。制备得到α-甘草酸和β-甘草酸对照品，为进一步研究提供了物质基础。
2. 本研究首次建立了反相高效液相色谱法同时测定甘草药材中甘草酸差向异构体的含量，并通过考察不同提取工艺确定了甘草药材的最佳提取工艺为0.6 g甘草，50 mL的50 %甲醇水，超声提取1次，每次10 min。通过考察多种不同的色谱条件确定最佳条件为甲醇-1 %醋酸水（6634, v/v），Hypersil C18柱（250 mm× 4.6 mm i.d.，5 µm ，大连依利特仪器分析有限公司）。
采用本方法对19批甘草药材中的甘草酸差向异构体的含量进行了测定，结果表明，19批甘草药材中α-甘草酸的含量为0.103 6%～0.483 7%；β-甘草酸的含量为1.433%～5.510%。不同产地的甘草药材中α-甘草酸和β-甘草酸含量差别较大，除河北Ⅰ产地外其他产地α-甘草酸和β-甘草酸含量的总和都大于2 %。虽然不同产地甘草药材中α-甘草酸和β-甘草酸的含量差别较大，但是β-甘草酸和α-甘草酸含量的比值都在13:1左右，即α-甘草酸比β-甘草酸含量要低90 %多，与报道的只低5 %差别很大。同时也说明α-甘草酸和β-甘草酸彼此间达到一定平衡，以一定比例共存于甘草药材中。
3. 本研究首次建立了反相高效液相色谱法同时测定甘草酸二铵注射剂中甘草酸二铵差向异构体的含量。确定最佳色谱条件为甲醇-1 %醋酸水（6040, v/v），Ultimate XB- C18柱（250 mm× 4.6 mm i.d.，5 µm ，美国Welch公司）。采用本方法，对3批样品进行了测定，结果表明甘草酸二铵注射剂中α-甘草酸二铵的含量约为4.600 0 mg•mL-1，β-甘草酸二铵的含量约为0.850 0mg•mL-1，两者含量都较大。α-甘草酸比β-甘草酸有更强的抗肝炎、肝损伤等药理作用，然而文献报道甘草酸二铵注射剂的质量控制方法测的都是α-甘草酸二铵和β-甘草酸二铵的总含量，本研究将α-甘草酸二铵和β-甘草酸二铵分离进行含量测定，从而建立一个更准确、完善的甘草酸二铵注射剂质量标准，推动甘草酸二铵注射剂在临床上更合理和有效的应用。
4.本研究考察了甘草提取、浓缩、及干燥过程中提取时间和加热温度对甘草中α-甘草
酸和β-甘草酸稳定性的影响，结果表明，甘草药材提取过程中α-甘草酸和β-甘草酸1 h即
可提取完全，随着提取时间的增长，两者含量逐渐下降；当提取时间达到10 h的时候，α-甘草酸和β-甘草酸的峰面积都下降至78 %。同时提取过程中α体和β体彼此并未发生相互转化。建议工业生产中不宜长时间提取甘草酸。不同温度下甘草提取液中α体和β体含量稳定不变，两者未发生相互转化。因此工业生产中将甘草提取液减压浓缩制备甘草酸时可以高温加快旋蒸速度。
考察了放置时间和光照对α-甘草酸和β-甘草酸对照品稳定性的影响。放置时间和光照使甘草酸差向异构体混合对照品（β体α体 = 261）峰面积略有改变，存在α体向β体缓慢转化的趋势，两者达到331共存。本研究只对甘草酸差向异构体的稳定性做了初步探讨，
有待进一步研究。